Nghiên cứu cố định kháng thể HCG trên đế polystyrene sử dụng trong phân tích beta-HCG

thời gian ủ mẫu trong b) là 24h 
Để tìm điều kiện tối ưu cho quá trình cố định 
kháng thể hCG trên bề mặt giếng PS, chúng 
tôi thay đổi nồng độ hCG trong dung dịch hấp 
phụ ban đầu và thay đổi thời gian lưu rồi tiến 
hành đo huỳnh quang với các nồng độ kháng 
nguyên hCG chuẩn. Hình 2 là kết quả sự phụ 
thuộc của cường độ huỳnh quang theo nồng 
độ kháng nguyên hCG ở các điều kiện cố định 
kháng thể hCG khác nhau. Có thể thấy trên 
hình 2a, ở thời gian ủ ngắn, như 2h, cường độ 
huỳnh quang không biến đổi tuyến tính theo 
nồng độ của kháng nguyên hCG. Điều này là 
do mật độ kháng thể hCG cố định trên đế PS 
không ổn định từ mẫu này sang mẫu khác ở 
thời gian ủ ngắn. Khi tăng thời gian ủ mẫu, 
mật độ kháng thể hCG cố định được trên bề 
mặt PS tăng dần, thể hiện bởi cường độ huỳnh 
quang tăng, và đạt giá trị bão hòa sau thời 
gian 20h. Do đó, chúng tôi lựa chọn thời gian 
ủ mẫu là 24h cho tất cả các thí nghiệm tiếp 
theo. Hình 2b thể hiện sự phụ thuộc của 
cường độ huỳnh quang theo nồng độ kháng 
nguyên hCG khi thay đổi nồng độ của kháng 
thể hCG trong dung dịch hấp phụ và giữ 
nguyên thời gian ủ mẫu là 24h. Có thể thấy 
rằng, ở tất cả các nồng độ kháng thể hCG 
khảo sát, cường độ huỳnh quang tăng tuyến 
tính theo đồng độ kháng nguyên hCG. Kết 
quả này phù hợp với kết luận về sự hấp phụ 
bão hòa của kháng thể hCG trên bề mặt PS ở 
thời gian 24h trên hình 2a. Cường độ huỳnh 
quang đạt cực đại trên khoảng nồng độ kháng 
nguyên hCG khảo sát khi nồng độ kháng thể 
trong dung dịch hấp phụ là 2,50 μg/ml. Có thể 
ở nồng độ hCG cao hơn đã dẫn tới sự hấp phụ 
đa lớp xếp chồng lên nhau làm giảm mật độ của 
các vị trí hoạt động, vị trí sẽ bắt cặp với kháng 
nguyên hCG, trên bề mặt. Từ kết quả hình 2b, 
chúng tôi đi đến kết luận nộng độ hấp phụ tối 
ưu của kháng thể hCG là 2,50 μg/ml. 
Tạ Văn Thạo và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 208(15): 117 - 123 
 Email: jst@tnu.edu.vn 121 
0 1 2 3
2000
2200
2400
2600
2800
P
L
 I
n
te
n
s
it
y
 (
 c
o
u
n
ts
/s
e
c
) 
x
 1
0
0
0
Time (week)
a) b)
2200
2400
2600
2800
3000
3200
P
L
 I
n
te
n
s
it
y
 (
c
o
u
n
ts
/s
e
c
)
blank PAPP-A AFP Free -hCG
Hình 3. a) Ảnh hưởng của thời gian lưu đến cường độ huỳnh quang đo trên mẫu kháng nguyên hCG 
chuẩn. b) Cường độ huỳnh quang khi thực hiện quy trình phân tích trên mẫu trắng (blank) và trên một số 
loại protein khác nhau như PAPP-A, AFP, và β-hCG tự do 
Để đánh giá độ bền của lớp kháng thể hCG cố 
định trên bề mặt PS, chúng tôi lưu mẫu ở 4oC 
trong túi nilon kín. Sau các khoảng thời gian 
lưu khác nhau, đế PS có hCG cố định được sử 
dụng để tiến hành đo cường độ huỳnh quang 
với mẫu kháng nguyên hCG chuẩn có nồng 
độ 1030 ng/ml. Kết quả đo cường độ huỳnh 
quang trên 10 đế PS khác nhau được trình bày 
trên hình 3a. Có thể thấy, cường độ huỳnh 
quang trung bình giảm dần, giảm khoảng 5% 
sau 3 tuần lưu giữ. Giá trị này tương đương 
với độ lệch của cường độ huỳnh quang trong 
cùng một thời gian lưu chứng tỏ hoạt tính của 
kháng thể hCG được duy trì khá tốt trên đế 
PS khi lưu giữ ở 4oC trong túi nilon kín. 
Để đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp 
phân tích dựa vào đế PS gắn kháng thể hCG, 
chúng tôi tiến hành phép phân tích lập lại sử 
dụng một số loại protein khác nhau như 
PAPP-A, AFP và β-hCG tự do để thay thế 
kháng nguyển hCG. Cường độ huỳnh quang 
được so sánh trên hình 3b trong so sánh với 
mẫu trắng (blank). Kết quả cho thấy, cường 
độ huỳnh quang thu được khi phân tích các 
mẫu protein chỉ tương đương với mẫu trắng, 
hay tương đương với 1% cường độ tín hiệu 
thu được khi phân tích hCG (xem hình 3a). 
Điều này chứng tỏ kháng thể hCG cố định 
trên đế PS bắt cặp đặc hiệu với kháng 
nguyên hCG. 
0 2000 4000 6000 8000 10000
0
200
400
600
800
P
L
 I
n
te
n
s
it
y
 (
c
o
u
n
ts
/s
)
hCG (ng/ml) 
Hình 4. Đường chuẩn sự phụ thuộc của cường độ 
huỳnh quang vào nồng độ hCG. 
Hình 4 trình bày cường độ huỳnh quang theo 
nồng độ hCG và đường chuẩn. Phương trình 
đường chuẩn được xác định bằng phương pháp 
tối ưu hóa cường độ tín hiệu huỳnh quang ( y ) 
theo nồng độ ( x ) theo phương trình: 
0
x
ty y Ae

  ; 
trong đó 0y là cường độ huỳnh quang cực 
đại; t là nồng độ phân rã và A là thừa số 
trước hàm mũ. Các giá trị này được xác định 
bằng data fitting có trong phần mềm 
OriginPro 8 SR4. Để đánh giá độ tin cậy của 
phương pháp, chúng tôi đã tiến hành phân 
tích ngẫu nhiên các mẫu hCG và so sánh đối 
chứng với kết quả được phân tích theo quy 
trình chuẩn; kết quả được tổng hợp trong 
bảng 1. Có thể thấy rằng kết quả phân tích 
kháng nguyên hCG bằng phương pháp xây 
Tạ Văn Thạo và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 208(15): 117 - 123 
 Email: jst@tnu.edu.vn 122 
dựng trong nghiên cứu có độ tin cậy khá tốt, với sai lệch trung bình so với phương pháp phân tích 
chuẩn khoảng -2,1%. Sử dụng số liệu về tín hiệu huỳnh quang xác định trên mẫu trắng (hình 4b) 
và phương trình đường chuẩn (hình 5) giá trị giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn phân tích định 
lượng (LOQ) được xác định theo tài liệu [14 ] tương ứng là 11,9 ng/ml và 17,9 ng/ml. Kết quả 
này tốt hơn so với phương pháp phân tích miễn dịch huỳnh quang sử dụng hạt nano từ trong 
nghiên cứu [15]. 
Bảng 1. So sánh kết quả phân tích hCG mẫu thực 
Mẫu 
TN 
(ng/ml) 
ĐC 
(ng/ml) 
% 
sai khác 
Mẫu 
TN 
(ng/ml) 
ĐC 
(ng/ml) 
% 
sai khác 
HN01250419 810 870 -6,9 ND01270419 2437 2660 -8,4 
HN02250419 4460 4473 -0,3 HN02270419 1787 1899 -5,9 
HN03250419 1957 2107 -7,1 HN01050519 2513 2613 -3,8 
HD04250419 510 477 7,0 HP02050519 2847 2633 8,1 
HN05250419 4697 4400 6,7 HB03050519 1153 1192 -3,3 
HN06250419 1220 1300 -6,2 HN01110519 803 790 1,7 
HY01260419 1767 1907 -7,3 HN02110519 3207 3346 -4,2 
HN02260419 1463 1600 -8,5 HN02110519 3475 3450 0,7 
HN03260419 2380 2443 -2,6 HN03110519 2850 2787 2,3 
VP04260419 1487 1457 2,1 HN04110519 1773 1847 -4,0 
TN: Kết quả phân tích hCG theo quy trình thực nghiệm sử dụng đế PS cố định kháng thể hCG; ĐC: Kết 
quả phân tích hCG sử dụng KIT phân tích chuẩn. 
4. Kết luận 
Trong bài báo này, chúng tôi đã nghiên cứu 
tối ưu hóa điều kiện cố định kháng thể hCG 
lên bề mặt đế PS để sử dụng cho phân tích 
hCG theo cơ chế miễn dịch huỳnh quang. 
Điều kiện xác định được là nồng độ dung dịch 
hấp phụ là 2,5μg/L, thời gian hấp phụ là 24 
giờ. hCG vẫn giữ được hoạt tính trên đế PS 
trong khoảng thời gian từ 1 đến 3 tuần khi 
được bọc kín và lưu giữ ở 4oC. Quy trình 
phân tích miễn dịch huỳnh quang sử dụng đế 
PS gắn kháng thể hCG có độ chọn lọc đặc 
hiệu với kháng nguyên hCG; có giới hạn phát 
hiện và giới hạn phân tích . Kết quả phân 
tích hCG trên mẫu thực tế cho độ sai lệch 
trung bình -2,1% so với quy trình chuẩn. 
Lời cám ơn 
Nghiên cứu này được tài trợ từ nguồn kinh 
phí đề tài cấp Bộ, kinh phí KHCN của 
Trường ĐHSP Hà Nội 2 cho đề tài mã số: 
B.2018-SP2-13. Cảm ơn công ty 
ChemedicVN đã tài trợ chi phí phân tích các 
mẫu hCG đối sánh. 
TÀI LIỆU THAM KHẢO 
[1]. Glycoprotein hormones alpha chain precursor 
- Homo sapiens. UniProt accession number 
P01215. UniProt Consortium. 
[2]. Choriogonadotropin subunit beta 3 - Homo 
sapiens. UniProt accession number P01233. 
UniProt Consortium. 
[3]. D. Lachlan Hay, “Placental histology and the 
production of human choriogonadotrophin and its 
subunits in pregnancy”, British Journal of 
Obstetrics and Gynaecology, T.95, tr.1268-1275, 
1988. 
[4]. A. Schumacher, K. Heinze, J. Witte, E. 
Poloski, N. Linzke, K. Woidacki, A. C. Zenclusen, 
“Human chorionic Gonadotropin as a central 
regulator of pregnancy immnune tolerance”, The 
Journal of Immunology, T.190, pp. 2650-2658, 
2013. 
[5]. A. S. Bansal, S. A. Bora, S. Saso, J. R. Smith, 
M. R. Johnson, M-Y. Thum, “Mechanism of 
human chorionic gonadotrophin-mediated 
iummunodulation in pregnancy”, Expert Review of 
Clinical Immunology, T.8, S.8, pp. 747-753, 2012. 
[6]. U-H. Stenman, A. Tiitinen, H. Alfthan, L. 
Valmu, “The classification, functions and clinical 
use of different isoforms of HCG”, Human 
reproduction update, T.12, pp.769-784, 2006. 
[7]. Laurence A. Cole, “Antibodies and hCG 
tests”, in Human Chorionic Gonadotropin (hCG), 
Elsevier, second edition, 2015, pp. 313-320. 
Tạ Văn Thạo và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ ĐHTN 208(15): 117 - 123 
 Email: jst@tnu.edu.vn 123 
[8]. Laurence A. Cole, “Problems with today’s 
hCG pregnancy tests”, in Human Chorionic 
Gonadotropin (hCG), Elsevier, second edition, 
2015, pp. 323-334. 
[9]. Luigi Cinquanta, Desré E. Fontana, Nicola 
Bizzaro, “Chemiluminescent immunoassay 
technology: what does it change in autoantibody 
detection?”, Autoimmun Highlights, T.8, tr9, 2017. 
[10]. Weiping Qian, Danfeng Yao, Fang Yu, Bin 
Xu, Rong Zhou, Xiang Bao, Zuhong Lu, 
“Immobilization of Antibodies on Ultraflat 
Polystyrene Surfaces”, Clinical Chemistry, 
T.46,S.9, pp.1456-1463, 2000. 
[11]. K. R. Blomberg, V-M. Mukkala, H. H. O. 
Hakala, P. H. Makinen, M. U. Suonpaa, I. A. 
Hemmila, “A dissociative fluorescence 
enhancement technique for one-step time-resolved 
immunoassays”, Analytical and Bioanalytical 
Chemistry, T.399, pp. 1677-1682, 2011. 
[12]. T. K. Christopoulos, E. P. Diamandis, 
“Fluorescence immunoassays”, in Immunoassay, 
Academic Press, pp. 309-335, 1996. 
[13]. M. Hogmander, C. J. Paul, S. C. Elina, H. V. 
Eskonen, T. Pahikkala, S. Pihlasalo, 
“Luminometric label array for counting and 
differentiation of bacteria”, Analytical Chemistry, 
T.89, S.5, pp. 3208-3216, 2017. 
[14]. A. Shrivastava, V. B. Gupta, “Methods fof 
the determination of limit of detection and limit of 
quantitation of the analytical methods”, 
Chronicles of Young Scientists, T.2, S.1, pp.21-25, 
2011. 
[15]. Ng. T. B. Việt, T. V. Thạo, Ng. B. Ngân, Ng. 
V. Minh, “Nghiên cứu ứng dụng nano từ trong 
phân tích beta-hCG”, Tạp chí Khoa học & Công 
nghệ, T.50, tr. 96-99, 2019.