Bài giảng Miễn dịch học thú y - Chương 6: Phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể

ơng tính:
- Hồng cầu không tan lắng xuống đáy thành cục tròn đỏ, nước
ở bên trên trong. Đó là do: kháng nguyên + kháng thể tương
ứng + bổ thể.
- Bổ thể đã được sử dụng không còn cho hệ thống dung huyết.
Phản ứng dương tính chứng tỏ trong huyết thanh của vật nghi
có kháng thể tương ứng với kháng nguyên. Con vật mắc
bệnh.
Phản ứng âm tính:
- Hồng cầu bị tan, huyễn dịch có màu đỏ.
- Đó là do không có kháng thể tương ứng với kháng
nguyên, bổ thể không dùng cho hệ thống dung khuẩn
mà tham gia vào hệ thống dung huyết hồng cầu tan.
- Phản ứng âm tính, vật không mắc bệnh.
Phản ứng dương tính
Hồng cầu
Kháng thể kháng HC
Bổ thể từ HT của chuột
Kháng nguyên chuẩn
Kháng thể nghi
Phản ứng âm tính
Hồng cầu
Kháng thể kháng HC
Bổ thể từ HT của chuột
Kháng nguyên chuẩn
Kháng thể nghi
(4). Phản ứng trung hoà (Neutralization test)
 Một số kháng thể khi gặp kháng nguyên đã kích thích
sinh ra chúng như: virus, độc tố của vi khuẩn... sẽ làm cho
chúng không còn khả năng gây bệnh.
 Phản ứng kết hợp của kháng nguyên với kháng thể này
gọi là phản ứng trung hoà.
 Phản ứng trung hoà hay sử dụng là phản ứng trung hoà
độc tố và phản ứng trung hoà virus.
Phản ứng trung hoà độc tố của vi khuẩn
• Vi khuẩn uốn ván: Clostridium tetani.
• Vi khuẩn bạch hầu: Corynebacterium diphtheriae
• Những VK này có khả năng sản sinh ngoại độc tố và gây
bệnh nhờ độc tố này (Độc tố có bản chất là protein, có
tính KN cao).
• Độc tố rất độc, dưới tác dụng của một số yếu tố như nhiệt
độ, formol, độc tố mất độc tính trở thành giải độc tố,
nhưng tính kháng nguyên vẫn cao dùng làm vacxin.
• Khi tiêm giải độc tố vào cơ thể, cơ thể sản sinh kháng thể
đặc hiệu với độc tố, gọi là kháng độc tố.
• Khi kháng độc tố gặp độc tố, phản ứng trung hoà xảy ra
 độc tố không còn độc nữa.
• Phản ứng trung hoà độc tố có thể thực hiện trong cơ thể
động vật hoặc trong ống nghiệm.
• Nếu thực hiện phản ứng trung hoà trong ống nghiệm ta
thấy phức hợp kháng nguyên - kháng thể biểu hiện như
những cụm lông lơ lửng  vì vậy người ta gọi là phản
ứng lên bông.
Phản ứng trung hoà virus
Nguyên lý:
• Trên đối tượng nuôi cấy virus: phôi gà, động vật cảm
thụ, môi trƣờng tế bào, virus sẽ nhân lên và gây bệnh
tích cho các đối tượng trên.
• Khi virus + kháng thể dịch thể đặc hiệu tương ứng 
virus sẽ bị trung hoà  không nhân lên được và không
gây bệnh tích.
 Phản ứng trung hoà có 2 phƣơng pháp.
 Phương pháp thứ nhất:
 Huyết thanh không pha loãng (cố định), virus pha loãng.
 Theo phương pháp này virus được pha loãng theo cơ số 10: 10-
1 10-7..., rồi hỗn hợp với một lượng tương đương huyết thanh
miễn dịch ở mỗi nồng độ. Để ở nhiệt độ phòng 30'  1 giờ, rồi
đem gây nhiễm cho đối tượng nuôi cấy virus (phôi gà hoặc động
vật thí nghiệm hoặc môi trường tế bào).
Mỗi nồng độ gây nhiễm cho 4 - 6 đối tượng nuôi cấy.
 Bằng phương pháp này người ta chuẩn độ được hiệu giá của
virus hỗn hợp trong huyết thanh
SƠ ĐỒ CỦA PHẢN ỨNG:
HuyÕt thanh
Sè
èng
Virus
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
HuyÕt thanh kh«ng
pha lo·ng, mçi èng
0,2ml
1
2
3
4
5
6
0,2 
ml 0,2 
ml 0,2 
ml 0,2 
ml 0,2 
ml 0,2 
ml
 Phương pháp thứ hai:
 Virus cố định, huyết thanh pha loãng.
 Theo phương pháp này, huyết thanh được pha loãng
theo cơ số 2 (1/2; 1/4; 1/18...), rồi hỗn hợp với một
lượng virus nhất định (Nồng độ virus từ 100 đến 1000
TCID50, EID50, LD50, tuỳ mục đích thí nghiệm).
 Theo phương pháp này trước khi làm phản ứng phải
xác định được liều gây nhiễm hoặc liều gây chết 50%
đối tượng nuôi cấy virus (TCID50, EID50 và LD50).
 Phương pháp này ta xác định được hiệu giá của huyết
thanh trung hoà.
SƠ ĐỒ CỦA PHẢN ỨNG
Virus 
Sè 
èng
Huyết thanh
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
100LD50
(100LD50) mçi
èng 0,2ml
1
2
3
4
5
6
0,2 
ml 0,2 
ml 0,2 
ml 0,2 
ml 0,2 
ml 0,2 
ml
NHÓM CÁC PHẢN ỨNG KHÔNG 
NHẬN THẤY BẰNG MẮT THƢỜNG
 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang-IF (Immuno - fluorescent -
test)
Dùng chất đánh dấu là chất phát huỳnh quang (khi hấp thụ 1 ánh
sáng có bước sóng nhất định sẽ phát ra 1 ánh sáng có bước sóng
dài hơn).
* Nguyên lý:
Khi dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể đã được nhuộm bằng
chất phát huỳnh quang, rồi cho kết hợp với kháng nguyên cần
chẩn đoán. Nếu có phức hợp kháng nguyên - kháng thể khi soi
dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ phát sáng.
Dùng chất phát huỳnh quang:
- Fluorescent Isothiocyanat  cho màu xanh lục
- Rodamin: màu đỏ gạch
- Lixamin - Rodamin B (RB200) đỏ vàng da cam
Có 2 phương pháp: trực tiếp và gián tiếp.
* Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp:
Trong phản ứng này thường dùng kháng thể đặc hiệu nhuộm chất
phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên chưa biết.
Cách làm:
- Lấy bệnh phẩm cần chẩn đoán, làm thành tiêu bản (phiết bệnh
phẩm lên phiến kính, cố định) để kháng nguyên gắn chặt lên
phiến kính.
- Rỏ một giọt kháng thể đặc hiệu đã gắn chất phát huỳnh quang lên
tiêu bản.
- Để một thời gian 30 phút, rửa nước, để khô, quan sát dưới kính
hiển vi huỳnh quang (ánh sáng tia tử ngoại). Đọc kết quả.
+ Phản ứng dương tính: Có hiện tượng phát sáng do có sự kết
hợp của kháng nguyên - kháng thể đã gắn chất phát huỳnh
quang.
+ Phản ứng âm tính: Không có phát sáng, do không có sự kết
hợp kháng nguyên - kháng thể.
Kết quả phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
Miễn dịch huỳnh quang
 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
• Dùng kháng kháng thể được nhuộm chất phát huỳnh quang để phát
hiện kháng nguyên cần chẩn đoán.
• Phương pháp này có 3 thành phần tham gia phản ứng.
- Kháng nguyên cần chẩn đoán
- Kháng thể đặc hiệu
- Kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang.
• Trong đó kháng thể đặc hiệu có 2 chức năng:
- Là kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần chẩn đoán
- Là kháng nguyên của kháng kháng thể đã đánh dấu.
Cách làm:
• Lấy bệnh phẩm cần chuẩn đoán làm tiêu bản để kháng nguyên gắn
chặt lên phiến kính.
• Nhỏ một giọt kháng thể đặc hiệu lên phiến kính. Ủ 370C/1h, rửa
nước.
• Nhỏ tiếp 1 - 2 giọt kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang. Ủ
370C/1h, rửa nước, để khô, quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Đọc kết quả.
- Phản ứng dương tính:
Có hiện tượng phát sáng, tức là có hiện tượng kết hợp kháng
nguyên + kháng thể + kháng kháng thể gia súc mắc bệnh.
- Phản ứng âm tính:
Không có hiện tượng phát sáng, tức là không có hiện tượng kết
hợp kháng nguyên + kháng thể + kháng kháng thể. Bởi vì kháng
nguyên và kháng thể không tương ứng, không có sự kết hợp
kháng nguyên - kháng thể, kháng thể bị rửa trôi.
Phƣơng pháp gián tiếp hay đƣợc sử dụng vì:
- Chỉ cần một lần gắn kháng kháng thể với chất huỳnh quang ta
có thể sử dụng để chẩn đoán nhiều kháng nguyên khác nhau, với
điều kiện kháng thể đặc hiệu của chúng phải được chế trên cùng
một loài vật.
- Độ nhạy của phản ứng cao hơn, bởi vì 1 phân tử kháng nguyên
có thể bị nhiều kháng thể bám vào  độ phát quang tăng lên,
dễ phát hiện.
Kết quả phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
 Kỹ thuật Sandwich Immunofluorescence Assay ("Bánh mì
kẹp chả")
 Đây là một dạng cải biến của miễn dịch huỳnh quang, dùng để
phát hiện tế bào tiết kháng thể.
 Cắt một mảnh tổ chức dạng lympho, đặt mảnh tổ chức lên
phiến kính.
 Lấy kháng nguyên phủ lên mảnh cắt. Để một thời gian, rửa
nước, loại bỏ kháng nguyên chưa gắn với kháng thể đặc hiệu
trên bề mặt tế bào lympho.
 Nhỏ tiếp kháng thể đặc hiệu đã gắn chất phát huỳnh quang, để
một thời gian, rửa nước, để khô, quan sát dưới kính hiển vi
huỳnh quang. Đọc kết quả.
- Nếu có hiện tượng phát sáng, chứng tỏ các tế bào đang sản xuất
kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên.
 Phản ứng miễn dịch gắn enzim (Enzim linked Immuno
Sorbent Assay - ELISA)
Nguyên lý:
Dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzim, rồi cho kết hợp
trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên, sau đó cho cơ chất đặc
hiệu với enzim vào, cơ chất sẽ kết hợp với enzim đã gắn tạo nên
màu
 Phản ứng ELISA trực tiếp: Dùng để chẩn đoán kháng nguyên
- Cho kháng nguyên cần chẩn đoán vào (kháng nguyên được chiết
xuất ở dạng hoà tan) để độ 1 giờ, rửa nước (loại bỏ những thành
phần thừa).
- Cho kháng thể đặc hiệu đã gắn enzim vào. Để một thời gian, rửa
nước.
- Cho cơ chất đặc hiệu với enzim vào, để một thời gian (20 - 30').
Đọc kết quả.
+ Nếu có màu tức là có kháng nguyên tương ứng với kháng thể đặc
hiêu, phản ứng dương tính.
+ Nếu không có màu: Phản ứng âm tính.
Phản ứng ELISA trực tiếp
ELISA
 Phản ứng ELISA gián tiếp: Dùng để phát hiện kháng thể
- Cho kháng nguyên đã biết hấp phụ lên bản nhựa, để một thời gian
(qua đêm), rửa nước để loại kháng nguyên thừa.
- Cho huyết thanh cần chẩn đoán vào, ủ 1 giờ/370C. Rửa nước loại
bỏ thành phần thừa.
- Cho kháng kháng thể tương ứng gắn enzim vào, ủ 1 giờ/370C, rửa
nước.
- Cho cơ chất đặc hiệu với enzim vào, ủ 1 giờ/370C, đọc kết quả.
Phản ứng dương tính: Có màu xuất hiện
So màu trong quang phổ kế để định lượng mức độ của phản ứng.
Phản ứng âm tính: Không có màu xuất hiện
Trong phản ứng ELISA enzim có hoạt tính cao hay sử dụng
peroxydase, cơ chất dùng với enzim là 3,3' diaminobenzidin, dưới
tác dụng của enzim tạo màu nâu.
Phản ứng ELISA có độ nhậy cao.
Phản ứng ELISA gián tiếp
 Phản ứng miễn dịch phóng xạ (RIA: Radio Immuno Assay)
Dùng chất đánh dấu là đồng vị phóng xạ như I125, phát hiện bằng
máy đếm gamma (máy đo đồng vị phóng xạ).
• Nguyên lý (giống nhƣ miễn dịch huỳnh quang).
Khi dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể được gắn đồng vị phóng
xạ, rồi cho kết hợp với kháng nguyên cần chuẩn. Nếu có phức hợp
kháng nguyên - kháng thể, khi đo trong máy đo đồng vị phóng xạ sẽ
có nhấp nháy.
Có 2 phƣơng pháp: Trực tiếp và gián tiếp.
Độ nhạy của phản ứng rất cao.
Độ nhạy của một số phản ứng huyết thanh học
+ Phản ứng kết tủa trong môi trường đặc, phát hiện được kháng
nguyên ở nồng độ: 3 g/ml
+ Phản ứng ngưng kết trực tiếp 0,5g/ml
+ Phản ứng ngưng kết gián tiếp 0,001 g/ml
+ Kết hợp bổ thể 0,1 g/ml
+ Miễn dịch huỳnh quang 0,1 g/ml
+ Miễn dịch enzim  0,00001 g/ml
+ Miễn dịch phóng xạ 0,000001 g/ml