Bài giảng Kết hợp kháng nguyên, kháng thể - Đỗ Hòa Bình
Trình bày các đặc tính và lực liên kết của phản ứng kết hợp kháng nguyên (KN)-kháng thể (KT).
Trình bày nguyên lý và các loại phản ứng tủa
Trình bày nguyên lý và các loại phản ứng ngưng kết
Trình bày các loại miễn dịch đánh dấu
Tóm tắt nội dung Bài giảng Kết hợp kháng nguyên, kháng thể - Đỗ Hòa Bình, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút "TẢI VỀ" ở trên
ới các nguyên tử mang điện âm (N,O) Chuyển động của các đám mây điện tử xung quanh các phân tử làm cho phân tử có cực Các nhóm kỵ nước gần nhau tương tác và giải phóng các phân tử H20 30/1/2007 1.3. Khái niệm epitop và paratop Epitop là vị trí kháng nguyên kết hợp trực tiếp với kháng thể. Có nhiều loại epitop khác nhau (xem hình) Paratop là vị trí của kháng thể kết hợp với kháng nguyên KN nhỏ: 2 epitop; Vị trí KHKN: 2 KN trung bình: 6 epitop;KHKN: 4 KN lớn: 10 epitop; KHKN: 8 KN vừa: 6 epitop; Vị trí KHKN: 4 KN lớn: 10 epitop; Vị trí KHKN: 8 30/1/2007 1.4. Ái tính và háo tính 1.4.1. Ái tính (affinity) của KTvới KN được biểu thị bằng tổng hợp tất cả các lực liên kết giữa 1 paratop với 1 epitop. KT + KN KN-KT [KN.KT] [KN]x[KT] K K: là hằng số kết hợp Sự kết hợp và phân ly của 1 KN đơn hóa trị Sự kết hợp và phân ly của 1 KN đa hóa trị 30/1/2007 1.4.2. “ Háo tính ”(avidity) của KT là biểu thị tất cả các lực liên kết giữa các KT và KN đa hóa trị Háo tính phụ thuộc vào số epitop của KN và số hóa trị của KT (IgG, IgM..), pH, các lực, nhiệt độ và hằng số kết hợp. Ái tính có ý nghĩa lý thuyết, còn háo tính có ý nghĩa thực tế. Sự kết hợp và phân ly của 1 KN đơn hóa trị Sự kết hợp và phân ly của 1 KN đa hóa trị 30/1/2007 Phản ứng tủa Phản ứng ngưng kết Phản ứng miễn dịch đánh dấu 2. CÁC LOẠI PHẢN ỨNG KẾT HỢP KN-KT 30/1/2007 2.1. Phản ứng tủa Nguyên lý chung . Các KN hoặc KT ở dạng hòa tan kết hợp với KT hoặc KN đặc hiệu tương ứng tạo thành các phức hợp miễn dịch (tủa) có thể nhìn thấy được. Các loại phản ứng tủa: Môi trường lỏng Môi trường gel Thừa KT Tương đương Thừa KN Lượng KN thêm vào Lượng KT ngưng kết 30/1/2007 2.1.1. Phản ứng tủa trong môi trường lỏng để phát hiện KN hoặc KT (Định tính) - Cho KT vào mỗi ống nghiệm - Nhỏ từ từ KN lên trên lớp KT - Vòng tủa xuất hiện giữa 2 lớp KN và KT (ống 5) - Các ống chứng: 1,2,3,4: 1 Vòng tủa 3 4 5 2 2.1.1.1. Vòng tủa trong môi trường lỏng 30/1/2007 KN 100µl KT 100µl Tủa : mờ, đục 1 2 2.1.1.2. Tủa đều trong môi trường lỏng - Cho KT vào một ống nghiệm - Thêm một lượng KN tương ứng - Lắc đều và quan sát tủa hình thành 30/1/2007 Dung dịch đệm KN KT Lượng KN tăng dần Thừa KN Thừa KT Lượng tủa Tương đương 2.1.2.3. Kết tủa trong môi trường lỏng: Heidelberger và Kendall 30/1/2007 2.1.2. Kết tủa trong môi trường gel (argarose) Khuếch tán một chiều trong gel Khuếch tán vòng kép-Ouchterlony. Điện di đối lưu, kỹ thuật Kohn Điện di miễn dịch. 2.1.2.1. Định tính 2.1.2.2. Định lượng Khuếch tán vòng đơn. Mancini Điện di tên lửa-Laurell Điện di miễn dịch hai chiều 30/1/2007 Khuếch tán vòng kép-Ouchterlony Nguyên lý KN và KT hòa tan từ 2 vị trí khác nhau khuyếch tán vào môi trường gen thạch sẽ tạo nên đường tủa khi gặp KT và KN tương ứng. Tiến hành Chuẩn bị lam kính: Lam rửa sạch, để khô, đánh số và đặt trên mặt phẳng thăng bằng. Đun sôi cách thủy dung dịch gen thạch (1,5% trong đệm Veronal pH 8,6) để gen thạch tan đều. Dùng pipette trải trên mỗi lam kính 2,5 ml gen thạch sao cho lớp gen thạch dàn đều và có độ dày khoảng 3mm. Để ở nhiệt độ phòng cho thạch đông lại, sau đó để ở 4độ C khoảng 15-20 phút cho thạch đông chắc. Dùng khuôn để đục các lỗ trên bảng thạch, khoảng cách giữa các lỗ khoảng 5-7 mm. Dùng ống mao dẫn cho KN và KT vào các lỗ. Để các lam vào buồng ẩm trên một tiết diện phẳng, ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Đọc kết quả Nếu KN và KT là đặc hiệu thì giữa 2 lỗ sẽ hình thành 1 vệt tủa trắng đục. 30/1/2007 Khuếch tán vòng kép-Ouchterlony KN KT β 2 m thỏ KT kháng β 2 m Cơ chế hình thành hình cựa gà β 2 m lợn 1 3 2 KN1 KN1 KT1 KN1 KN2 KT1 KT2 30/1/2007 Điện di miễn dịch Nguyên lý : Gồm 2 bước Bước 1: Điện di dung dịch KN (HT người) để tách riêng các thành phần KN khác nhau. Bước 2: Phản ứng tủa miễn dịch. Tiến hành Chuẩn bị lam gen thạch: Giống như Ouchterlony Đục 1(hay 2) giếng ở gianh giới 1/3 lam gen thạch, nhỏ KN vào đó (huyết thanh người và IgG). Đặt lam gen thạch vào máy điện di sao cho lỗ chứa KN gần cực âm hơn cực dương. Kết quả, tốc độ di chuyển của các thành phần KN trong huyết thanh sẽ khác nhau tùy theo TLPT. Bỏ lam gen thạch ra khỏi máy, đục một rãnh dài theo chiều dọc lam gen thạch và nhỏ vào đó KT(kháng HT người toàn phần) và chút ít chất đánh dấu. Để lam thạch vào buồng ẩm trên một tiết diện phẳng, ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Đọc kết quả : KN và KT tương ứng sẽ khuếch tán và hình thành các vệt tủa trắng đục. 30/1/2007 Điện di miễn dịch + Nơi để huyết thanh Rãnh để kháng HT + - - - Lam kính đã phủ kín một lớp gel - KN: HT người bình thường - KT: Kháng HT người bình thường (ngựa) 30/1/2007 Kỹ thuật Mancini Nguyên lý: KN hòa tan từ một giếng khuếch tán ra xung quanh vào gen thạch chứa KT tương ứng. Sự tiếp xúc KN-KT sẽ tạo một vòng tủa hình tròn. Diện tích vòng tủa tỉ lệ thuận với nồng độ KN. Tiến hành Điều chế gen thạch chứa KT: Đun sôi cách thủy gen thạch cho tới khi tan đều, để gen thạch và KT vào nồi ấm cách thủy 56độ C. Cho KT vào gen thạch theo tỉ lệ 2-5%. Đổ gen thạch chứa KT lên lam kính sao cho lớp gen thạch có độ dày 2mm, để ở nhiệt độ phòng 20-30 phút, sau để ở 4độ C cho đông. Dùng khuôn có đường kính 2mm đục các lỗ trên bản gen thach(khoảng cách giữa các lỗ 7-8mm tùy nồng độ KN). Cho vào các lỗ Dd cần thử và 3 nồng độ KN chuẩn tương ứng đã biết để vẽ đường chuẩn. Để lam thạch vào buồng ẩm trên một tiết diện phẳng, ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Đọc kết quả: KN và KT tương ứng sẽ khuếch tán và hình thành các vòng tủa trắng đục. Căn cứ vào đường chuẩn, sẽ tính được nồng độ KN của mẫu thử. 30/1/2007 Mancini- KN: HT ngựa bình thường+ KT kháng chuỗi gamma A B C 1 2 3 4 5 6 Đường kính vòng tủa (mm) Nồng độ IgG (mg/ml) - Gel chứa KT - A6 - A1:HT ngựa: Không pha loãng, ½, ¼ - B: IgG ngựa tinh khiết đã biết nồng độ (từ trái sang phải: 30,15,7,2 và 15 mg/ml) - C: Các mẫu HT ngựa cần định lượng IgG 30/1/2007 Điện di tên lửa Nguyên lý: KN di chuyển trong điện trường gặp KT tương ứng trong gen sẽ tạo một vòng tủa hình “tên lửa”. Chiều dài hình “tên lửa” tỉ lệ thuận với nồng độ KN, kết quả đọc sau 2-6 giờ thay vì 48 giờ của Mancini. Tiến hành 1. Điều chế gen thạch chứa KT: Đun sôi cách thủy gen thạch cho tới khi tan đều, để gen thạch và KT vào nồi ấm cách thủy 56độ C. Cho KT vào gen thạch theo tỉ lệ 2-5%. 2. Đổ gen thạch chứa KT lên lam kính sao cho lớp gen thạch có độ dày 2mm, để ở nhiệt độ phòng 20-30 phút, sau để ở 4độ C cho đông. 3. Dùng khuôn có đường kính 2mm đục các lỗ trên bản gen thach(khoảng cách giữa các lỗ 7-8mm tùy nồng độ KN). 4. Cho vào các lỗ Dd cần thử và 3 nồng độ KN chuẩn tương ứng đã biết để vẽ đường chuẩn. 5. Để lam thạch vào máy điện di, KN di chuyểntrong điện trường gặp KT tương ứng trong gen sẽ tạo một vòng tủa hình “tên lửa”. Đọc kết quả: Sau 2-6 giờ thay vì 48 giờ của Mancini. Chiều dài hình “tên lửa” tỉ lệ thuận với nồng độ KN. 30/1/2007 Điện di tên lửa KT đã được trộn đều trong gel Nồng độ KN 30/1/2007 Nơi đặt mẫu KT đã trộn đều trong gel Điện di miễn dịch hai chiều 30/1/2007 2.2. Phản ứng ngưng kết 2.2.1. Nguyên lý chung: KN nằm trên bề mặt tế bào (hồng cầu, bạch cầu) hoặc các hạt nhân tạo mang kháng nguyên kết hợp với KT đặc hiệu tạo thành các mạng lưới KN-KT (ngưng kết) và có thể quan sát được. 30/1/2007 2.2.2. Các loại ngưng kết: Chủ động (KN là các tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, tinh trùng). Thụ động (KN hoặc KT gắn nhân tạo lên các hạt Khi KN gắn lên hạt nhân tạo như HC nhóm O, HC cừu hoặc hạt latex thì phản ứng gọi là ngưng kết thụ động thuận, còn khi KT gắn lên các hạt trên thì gọi là thu động ngược ). 30/1/2007 2.2.3. Một số ví dụ. Ngưng kết chủ động (xác định nhóm hồng cầu) Các loại hồng cầu Các cấu trúc cacbohydrat Các loại HT KTK A&B KTK B KTK A Không KTK A&B HT mẫu Các loại hồng cầu 30/1/2007 Mẹ Rh - , Con Rh + Trực tiếp Gián tiếp HC con+KT mẹ Huyết thanh mẹ Thêm HC Rh + và rửa KT không gắn +KT thỏ kháng Ig người +KT thỏ kháng Ig người Ngưng kết Nghiệm pháp Cooms trực tiếp và gián tiếp 30/1/2007 Phản ứng miễn dịch đánh dấu 1. Nguyên lý chung KN hoặc KT được gắn với các chất “đánh dấu”(enzym, chất màu huỳnh quang, phóng xạ) sẽ làm tăng khả năng nhận biết phức hợp KN-KT lên rất nhiều lần. 30/1/2007 2. Đặc điểm: Độ nhạy rất cao: có thể phát hiện được các phân tử KN hoặc KT ở nồng độ hoặc mật độ thấp Các chất đánh dấu không làm biến tính KN hoặc KT và không dễ bong Thường phải đọc kết quả ở các thiết bị chuyên dụng. 30/1/2007 3. Các loại kỹ thuật đánh dấu 3.1. Kỹ thuật MD huỳnh quang Nguyên lý: Phát hiện phản ứng MD nhờ đánh dấu bằng chất màu huỳnh quang, sau đó quan sát phản ứng KN-KT dưới kính HVHQ Nhận định kết quả (hình vẽ) Ánh sáng kích thích Ánh sáng phát ra 30/1/2007 Các loại kỹ thuật MDHQ MDHQ trực tiếp: Xác định các kháng nguyên trên bề mặt tế bào hoặc lát cắt tổ chức MDHQ gián tiếp: Phát hiện kháng thể có trong huyết thanh mẫu thử Kỹ thuật bánh kẹp “Sandwich”: phát hiện kháng nguyên trong huyết thanh mẫu thử 30/1/2007 3.2. Kỹ thuật ELISA . Nguyên lý : Phát hiện phản ứng MD nhờ đánh dấu bằng enzyme, sau đó quan sát phản ứng KN-KT bằng mắt thường hoặc máy . Một số kỹ thuật ELISA thường dùng + Gián tiếp: phát hiện KT/ huyết thanh người thử và bệnh nhân + Sandwich: phát hiện KN/ huyết thanh người thử và bệnh nhân Mẫu 1: KN A Mẫu 2: KN B Thêm KT kháng A gắn Enzyme Rửa KT Ko gắn Enzyme phân hủy cơ chất, tạo màu Đo độ hấp phụ ánh sáng 30/1/2007 3.3. Kỹ thuật MD phóng xạ Nguyên lý:Tương tự hai kỹ thuật trên chỉ khác chất là đồng vị phóng xạ (thimidin H3, Cacbon 14...) 30/1/2007
File đính kèm:
bai_giang_ket_hop_khang_nguyen_khang_the_do_hoa_binh.ppt
